GS. Tong Zhang STOTEN, Đại học Hồng Kông: Đánh giá các phương pháp phát hiện virus corona mới trong nước thải

Việc phát hiện và phân tích coronavirus mới (SARS-CoV-2) trong nước thải sau khi bùng phát có thể cung cấp thông tin hỗ trợ quan trọng cho xét nghiệm y tế, bao gồm cả việc cung cấp tín hiệu cảnh báo sớm về sự bùng phát, theo dõi sự phát triển của dịch bệnh trong cộng đồng và xác định các trường hợp không nhìn thấy được trong cộng đồng.

Không giống như mẫu lâm sàng, RNA neocoronavirus trong mẫu nước thải bị pha loãng rất nhiều do ảnh hưởng của dân số cộng đồng, và do đó, cần phải cô đặc virus trước khi xét nghiệm. Bài báo này đánh giá tác động của mười một quy trình phương pháp luận khác nhau đối với hiệu quả phát hiện neocoronavirus trong nước thải, bao gồm so sánh tám phương pháp thể tích nhỏ, so sánh phương pháp thể tích lớn so với phương pháp thể tích nhỏ và so sánh hai phương pháp chiết xuất khác nhau.

Tóm tắt hình ảnh | Graphical abstract

Lời giới thiệu

Việc phát hiện và phân tích coronavirus mới (SARS-CoV-2) trong nước thải sau khi bùng phát có thể cung cấp thông tin hỗ trợ quan trọng cho xét nghiệm y tế, bao gồm cả việc cung cấp tín hiệu cảnh báo sớm về sự bùng phát, theo dõi sự phát triển của dịch bệnh trong cộng đồng và xác định các trường hợp không nhìn thấy được trong cộng đồng. Không giống như mẫu lâm sàng, RNA neocoronavirus trong mẫu nước thải bị pha loãng rất nhiều do ảnh hưởng của dân số cộng đồng, và do đó, cần phải cô đặc virus trước khi xét nghiệm. Bài báo này đánh giá tác động của mười một quy trình phương pháp luận khác nhau đối với hiệu quả phát hiện neocoronavirus trong nước thải, bao gồm so sánh tám phương pháp thể tích nhỏ, so sánh phương pháp thể tích lớn so với phương pháp thể tích nhỏ và so sánh hai phương pháp chiết xuất khác nhau.

So sánh tám phương pháp cô đặc sử dụng thể tích ban đầu nhỏ

Các mẫu nước thải thu thập được đã được khử hoạt tính và sau đó virus SARS-CoV-2 đã được khử hoạt tính được thêm vào để đánh giá phương pháp. Đối với các mẫu có thể tích nhỏ, tám quy trình phương pháp luận dựa trên bốn nguyên tắc phương pháp luận khác nhau đã được đánh giá. Người ta thấy rằng phương pháp siêu ly tâm cho thấy khả năng phục hồi cao nhất (25,4 ± 5,9%) và cao hơn đáng kể (p < 0,01) so với các nguyên tắc phương pháp khác, tiếp theo là lắng và siêu lọc ly tâm, và cuối cùng là hấp phụ màng-khuếch tán (Hình 1).

Hình 1 So sánh tám phương pháp thể tích nhỏ

(a) Giá trị Ct (b) phục hồi UC: Siêu ly tâm (150.000 × g, 60 phút); AlCl3: Kết tủa và kết tủa AlCl3 (1%, 0,3 M, v/v); PEG: Kết tủa PEG (10% PEG, w/v, và 2% NaCl, w/v); MgCl2: Kết tủa MgCl2 (1%, 2,5 M, v/v). A15: Siêu lọc ly tâm (sử dụng bộ lọc ly tâm Amicon-Ultra 15 có tương đương phân tử 10 kDa); C70: Siêu lọc ly tâm (sử dụng bộ lọc ly tâm Centricon Plus-70 có tương đương phân tử 30 kDa); AlM: Hấp phụ màng-khuếch tán (0,45% NaCl, w/v, và 2% NaCl, w/v); MgCl2: Kết tủa MgCl2 (1%, 2,5 M, v/v); AlM: Hấp phụ màng-khuếch tán (0,45% NaCl sau khi thêm AlM: Hấp phụ màng-khuếch tán (màng lọc tích điện âm 0,45 μm sau khi thêm AlCl3 để hấp phụ-khuếch tán); MgM: Hấp phụ màng-khuếch tán (màng lọc tích điện âm 0,45 μm sau khi thêm MgCl2 để hấp phụ-khuếch tán).

So sánh các phương pháp cô đặc thể tích lớn và thể tích nhỏ

Để khám phá khả năng sử dụng thể tích nước thải lớn hơn (1000 mL) để cải thiện độ nhạy của phương pháp, ba phương pháp thể tích lớn đã được so sánh với phương pháp thể tích nhỏ tối ưu (siêu ly tâm). Trong các mẫu nước thải được bổ sung SARS-CoV-2, mặc dù độ nhạy của phương pháp siêu ly tâm thể tích lớn tốt hơn so với hai phương pháp thể tích lớn khác (kết tủa AlCl3 và hấp phụ màng), nhưng nó chỉ đạt được độ nhạy tương tự như phương pháp siêu ly tâm thể tích nhỏ. Trong các mẫu nước thải được bổ sung SARS-CoV-2 và ở nồng độ ngưỡng, cả hai phương pháp thể tích lớn và thể tích nhỏ đều đạt được phạm vi phát hiện như nhau. Trong 35 mẫu nước thải thực tế không được bổ sung SARS-CoV-2, các phương pháp siêu ly tâm thể tích lớn và thể tích nhỏ cho thấy tỷ lệ phát hiện như nhau, với phương pháp thể tích lớn có giá trị Ct thấp hơn một chút (0,67 Ct) so với phương pháp thể tích nhỏ. Kết quả này cho thấy rằng việc tăng thể tích nước thải không cải thiện đáng kể độ nhạy của phương pháp, có thể là do hiệu ứng ma trận của nước thải được cô đặc đồng bộ trong phương pháp thể tích lớn, điều này không thuận lợi cho việc chiết xuất và phát hiện RNA sau đó.

Hình 2 So sánh các phương pháp thể tích lớn và thể tích nhỏ

(a) So sánh giá trị Ct giữa ba phương pháp thể tích lớn và phương pháp thể tích nhỏ tối ưu; (b) So sánh giá trị Ct giữa các phương pháp siêu ly tâm thể tích lớn và thể tích nhỏ dựa trên 35 mẫu nước thải thực tế không được dán nhãn.

Large-UC: siêu ly tâm thể tích lớn (20.000 × g trong 30 phút, sau đó 150.000 × g trong 60 phút); AlCl3: Kết tủa và kết tủa AlCl3 (1%, 0,3 M, v/v); Màng: hấp phụ màng-khuếch tán (hấp phụ-khuếch tán sử dụng màng 0,45 μm tích điện âm); Small-UC: siêu ly tâm thể tích nhỏ (150.000 × g trong 60 phút). UC: siêu ly tâm thể tích nhỏ (siêu ly tâm 150.000 × g trong 60 phút).

Bảng 1 Tỷ lệ phát hiện và giá trị Ct đối với các mẫu nước thải được bổ sung SARS-CoV-2 ở nồng độ tới hạn và đối với các mẫu nước thải thực tế không được bổ sung.

So sánh hai phương pháp chiết xuất

Một phương pháp siêu ly tâm thể tích nhỏ đã được sử dụng để cô đặc các mẫu nước thải bằng cách so sánh hai phương pháp chiết xuất RNA khác nhau. Kết quả cho thấy bộ dụng cụ QIAamp Viral RNA Kit (Viral Kit) có thể phát hiện các giá trị Ct thấp hơn so với bộ dụng cụ TRIzol Plus RNA Purification Kit (TRIzol Kit) trong các mẫu nước thải được bổ sung SARS-CoV-2 với các hiệu ứng ma trận khác nhau (Hình 3a), và bộ dụng cụ QIAamp Viral RNA Kit (Viral Kit) có thể phát hiện một phạm vi nồng độ lên đến các mẫu nồng độ thấp trong các mẫu nước thải được bổ sung SARS-CoV-2 và ở nồng độ tới hạn trong các mẫu nước thải, bộ dụng cụ Viral Kit có thể phát hiện một phạm vi nồng độ lên đến các mẫu nồng độ thấp, trong khi bộ dụng cụ TRIzol Kit chỉ có thể phát hiện các mẫu nồng độ trung bình (Bảng 1, Hình 3b). Trong các mẫu được pha loãng trong PBS (nước muối) hoặc thang độ nước thải, bộ dụng cụ Viral Kit cho thấy hiệu quả chiết xuất cao hơn so với bộ dụng cụ TRIzol Kit (Hình 3c và Hình 3d). Kết quả này cho thấy bộ dụng cụ Viral Kit hoạt động tốt hơn bộ dụng cụ TRIzol Kit, nhưng cả hai đều có kết quả chiết xuất tốt hơn.

Hình 3 So sánh hai phương pháp chiết xuất

(a) So sánh giá trị Ct của các mẫu nước thải được bổ sung SARS-CoV-2 với các hiệu ứng ma trận khác nhau; (b) So sánh giá trị Ct dựa trên 31 mẫu thực tế không được bổ sung; (c) So sánh giá trị Ct của các mẫu được bổ sung pha loãng thang độ với PBS; và (d) So sánh giá trị Ct của các mẫu được bổ sung pha loãng thang độ với nước thải.

Kết luận

Trong bài báo này, mười một phương pháp phát hiện coronavirus mới khác nhau, bao gồm các nguyên tắc phương pháp khác nhau, các thể tích nước thải khác nhau và các phương pháp chiết xuất khác nhau, đã được đánh giá bằng cả các mẫu nước thải SARS-CoV-2 được bổ sung và các mẫu nước thải thực tế không được bổ sung. Nhìn chung, phương pháp siêu ly tâm thể tích nhỏ kết hợp với bộ dụng cụ Viral Kit để chiết xuất RNA bằng phương pháp lysate virus cho phép phát hiện nhanh chóng và nhạy SARS-CoV-2 trong nước thải. Kết quả của nghiên cứu này cung cấp hỗ trợ dữ liệu và tham khảo cho việc áp dụng các phương pháp hiện có hoặc mới được phát triển để phát hiện nước thải SARS-CoV-2.